Las betalaínas que contiene la remolacha roja (Beta vulgaris) se utilizan a modo de colorantes en la industria alimentaria.
Desde que inauguré Scientia he tenido una historia rondándome por la cabeza. Un hecho ocurrido esta misma semana, y que hoy no les voy a descubrir, ha sido la señal que necesitaba para contarla. Comencemos.
Corría el año 2005 cuando Fernando Gandía Herrero, becario de investigación del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A de la UMU, realizaba su tesis doctoral. El principal objetivo de ella era obtener un pigmento violeta llamado betacianina perteneciente a la familia de las betalainas con gran interés biológico e industrial, a partir de la oxidación enzimática de diferentes moléculas. Para tal fin necesitaba una enzima y sus correspondientes sustratos.
Tenía la enzima, la polifenoloxidasa, una vieja conocida del blog. Se trata de una cuproproteína que cataliza dos tipos de reacciones acopladas a expensas de oxígeno molecular: la hidroxilación de monofenoles en posición orto para dar el correspondiente o-difenol (actividad monofenolasa) y la oxidación de o-difenoles a sus correspondientes o-quinonas (actividad difenolasa). Su estructura cristalina, con los átomos de cobre que forman parte de su centro activo en verde, los residuos de histidina que los rodean en azul y la superficie molecular en rojo, pueden verla en la siguiente imagen.
Estructura cristalina de polifenolxidasa
A pesar de tener la enzima caracterizada partir de diferentes fuentes como por ejemplo la remolacha, Fernando no disponía de los sustratos de la reacción… había que buscarlos.
Tras una exhaustiva revisión bibliográfica encontró que un posible tipo de sustratos de polifenoloxidasa de gran interés por su actividad antioxidante, de nombre betaxantinas, podía encontrarlos en algunas flores de plantas a las que confiere tonos amarillos. Tanto las coloraciones amarillas (betaxantinas) como las violetas (betacianinas) provocan que las betalaínas se utilicen actualmente como aditivos en la industria alimentaria para modificar el color de una amplia variedad de productos como yogures, cremas, helados, salchichas, jamón cocido, galletas, dulces y zumos, etc.
Fernando ya tenía sus sustratos en el ojo de mira. Solamente debía saber dónde encontrarlos en la naturaleza. No fue difícil. En su revisión bibliográfica pudo comprobar que las betalaínas se acumulan en flores, frutas y, de forma ocasional, en el tejido vegetativo de plantas de la mayoría de las familias del orden de las Cariofilales, que incluye familias como las Cactáceas (a las que pertenece el cactus) o las Nictagináceas (a las que pertenece Mirabilis jalapa, llamada comúnmente Dondiego de noche).
¿Cactus? Viviendo en una región desértica Fernando no lo dudó ni un segundo y se fue a la caza de cactus. De sus flores intentaría extraer y purificar las betaxantinas (sustratos de la reacción) que necesitaba para obtener betacianinas (productos de la reacción).
Flor de Cactáceas
Durante semanas estuvo recolectando flores de cactus. Una vez recogidas las suficientes, el siguiente paso era extraer de ellas las betalaínas. Para ello se necesitaban varios pasos de extracción y purificación. Si todo iba bien, al final de todos ellos los sustratos de la enzima polifenoloxidasa estarían listos para ser oxidados y así caracterizar la formación de betanidina… sin embargo, algo inesperado ocurrió en el proceso de purificación.
Uno de los pasos consistía en congelar con nitrógeno líquido las flores una vez machacadas para concentrar las betaxantinas que hubiesen en su estructura. En ese momento, Fernando se dio cuenta de algo que muchos investigadores que habían manipulado esas flores durante más de 50 años jamás lograron observar… o no supieron ver.
Al aplicar el hielo líquido a las flores para congelarlas, un destello fluorescente emergió de la flor del cactus. El entonces becario de investigación no contaba con ello. No podía ser. Al ser expuestas a la luz blanca, las flores emitían radiación fluorescente de una longitud de onda superior a la incidente. Nadie había descrito jamás un proceso de fluorescencia en el reino vegetal que implicase luz visible en los procesos de excitación y emisión y pudiese ser visto por el ojo humano. Todos los descritos anteriormente necesitaban luz ultravioleta. Este no… pero a pesar del desconcierto inicial la rápida reacción de Fernando fue la clave del éxito que vendría después.
Uno de los grandes pecados que cometemos muchos científicos cuando acometemos una investigación es no desviar la mirada del objetivo inicialmente previsto. Nos obcecamos en seguir la carretera planificada sin mirar ni a la derecha ni a la izquierda. Por eso, muchas veces pasamos por alto grandes ocasiones que se nos presentan en forma de caminos laterales que pueden ser mucho más interesantes que la gran autovía por la que circulábamos placenteramente.
Sin embargo, Fernando Gandía no es de esos… y esa es una de las muchas cualidades que tiene y que lo diferencia del resto de investigadores. Cuando vio que aquellas flores del cactus presentaban fluorescencia, rápidamente aparcó el objetivo inicial de limitarse a purificar las betalaínas. Ya habría tiempo de volver a él. Había que estudiar la fluorescencia de las betalaínas.
Tras un detallado estudio físico-químico observó no solo que el sistema de dobles enlaces conjugados del ácido betalámico, la unidad estructural de las betaxantinas, era el responsable del color de estos pigmentos sino que betaxantinas y betacianinas (sustratos y productos) ejercían un efecto contrario sobre la fluorescencia. Me explico.
El análisis espectroscópico comparativo entre betaxantinas y betacianinas reveló un solapamiento entre los espectros de emisión de las betaxantinas y los espectros de absorción de las betacianinas. Esta situación provoca que, cuando ambos tipos de pigmentos están juntos, se produzca una atenuación de la fluorescencia. Es el proceso que se conoce como “filtro interno”. ¿A qué me refiero con este nombre?
Por culpa del “efecto de filtro interno” un sistema que contenga simultáneamente un fluoróforo (estructura responsable de la fluorescencia) y un cromóforo (estructura responsable del color) que sea capaz de absorber la radiación emitida por el compuesto fluorescente, puede ver disminuida su fluorescencia. Ensayos experimentales mostraron que la adición progresiva de betacianinas a una disolución de betaxantinas provoca la extinción, por este efecto, de la fluorescencia. Ello demuestra que las betacianinas absorben la radiación emitida por las betaxantinas. A mayor presencia de betacianinas en una flor menor será su fluorescencia.
Finalmente, el aspirante a doctor observó que las betaxantinas presentan espectros con máximos de excitación comprendidos entre 463 y 475 nanómetros y máximos de emisión de entre 506 y 515 nanómetros. Es decir, las betaxantinas absorben luz en el rango visible del espectro electromagnético correspondiente al color azul y emiten luz verde…todo en el visible. Por ello podía verlas y no necesitaba de una lámpara de luz ultravioleta.
De acuerdo. Fernando ya había caracterizado espectroscópicamente la fluorescencia de las betaxantinas presentes en las flores del cactus pero… ¿cuál era la razón por las que antes no se había percatado de esa luz? ¿por qué solamente podía ver la fluorescencia de dichas flores al congelarlas? Si ustedes son fieles seguidores de este blog deberían saberlo.
En el post “Légolas, el elfo que cayó en la trampa del arándano… y de la cromatografía líquida de alta resolución” les expliqué que la fluorescencia de una molécula sufre un significativo incremento cuando aumenta su rigidez. En aquella ocasión la rigidez se incrementaba gracias a la encapsulación molecular de la molécula fluorescente. Sin embargo, en el caso de las betalaínas, la rigidez se alcanzaba al congelarlas. El fundamento es el mismo: la reducción del grado de libertad de una molécula fluorescente aumenta su rendimiento luminoso, bien sea por congelación o por encapsulación.
Fluorescencia visible en flores de Mirabilis jalapa. Cuando se ilumina con luz blanca (A y B), las áreas de las flores que contienen solo betaxantinas parecen amarillas debido a la combinación de fluorescencia y la radiación no absorbida, o reflejada. Cuando se ilumina con luz azul (C y D), las betaxantinas emiten fluorescencia verde.
Pero aun faltaba algo más… el “para qué” de la fluorescencia de los cactus. Ustedes me han leído muchas veces escribir que a las plantas, frutas o verduras les importa un pimiento que a nosotros nos fascinen sus colores, nos entusiasmen sus olores o nos desagrade su textura. Todos los procesos fisiológicos tienen un significado para el ser vivo que los desarrolla independientemente de si son del gusto o no del observador. Cuando una manzana se oxida aparecen unas manchas negras que no suelen gustar al consumidor… pero a la manzana le sirven para defenderse del ataque de patógenos.
El siguiente paso era proponer una posible hipótesis para conocer la razón por la que los cactus emitían aquella luz fluorescente… ¿qué ganaba el cactus con ello? ¿le servía para algo? ¿qué conseguía aquella luz fluorescente?
Fernando no podía imaginarse que una nueva sorpresa le esperaba detrás de aquella fascinante investigación. Él pensaba que su trabajo iba a abrir nuevas vías para el estudio de las relaciones entre animales y plantas, ya que hasta entonces no se había considerado la posibilidad de que la emisión de luz por parte de flores operara a modo de señal. Prepárense que llegan curvas.
Como todos ustedes saben los quirópteros (Chiroptera), conocidos comúnmente como murciélagos, son un orden de mamíferos placentarios cuyas extremidades superiores se desarrollaron como alas. Pues bien, aunque pocos quirópteros lo son completamente, antiguamente predominaba la creencia de que los murciélagos eran ciegos, como demuestra el origen de su nombre común, “murciélago”, que es una metátesis histórica de “murciélago”, formada por la expresión del castellano antiguo mur cego “ratón ciego”.
Sin embargo, aunque los ojos de la mayoría de los murciélagos son pequeños y están poco desarrollados, y tienen una baja agudeza visual, no se puede decir que sean ciegos. Un estudio publicado en PLOS One muestra que los murciélagos poseen diferentes fotorreceptores ya sea para la visión nocturna o la diurna.
Vale, perfecto, los murciélagos no son ciegos totalmente pero… ¿se puede saber qué pintan estos mamíferos alados entre las flores del cactus, la polifenoloxidasa, la fluorescencia y la historia de las flores congeladas? Paciencia.
Como todos ustedes saben la polinización es el proceso de transferencia del polen desde los estambres hasta el estigma o parte receptiva de las flores en las angiospermas, donde germina y fecunda los óvulos de la flor, haciendo posible la producción de semillas y frutos. El transporte del polen lo pueden realizar diferentes vectores de polinización entre los que se encuentran tanto vectores abióticos (agua o viento) como vectores bióticos (aves, insectos y…MURCIÉLAGOS).
Opuntia ficus indica (higo chumbo) siendo polinizada
Pues bien, Fernando volvió a encerrarse en la biblioteca y descubrió que existe una variedad de murciélago que es capaz de polinizar plantas de las Cactáceas pero en unas condiciones muy especiales. ¿A qué condiciones me refiero?
Aunque en la literatura podemos encontrar varios tipos de murciélagos que se alimentan del néctar de la plantas que emiten luz en el ultravioleta, este tipo de murciélago solamente es capaz de percibir luz cuyo máxima longitud de onda no se encuentra en el ultravioleta… sino en el visible.
¿Se imaginan ustedes a qué longitud de onda me refiero? Sí, la que ustedes están pensando. Según un artículo publicado en Nature un par de años antes, el murciélago Glossophaga soricina tiene un único receptor de luz con una longitud de onda máxima de 510 nanómetros, precisamente la longitud de onda del espectro del visible a la que emiten las betaxantinas presentes en el cactus… y esta podría ser la explicación a que este murciélago solamente sea capaz de polinizar las plantas que emiten fluorescencia a esta longitud de onda…no ve otras.
¿Estoy diciendo que las flores del cactus emiten luz fluorescente en el visible a una longitud de onda de 510 nm y entonces el murciélago Glossophaga soricina gracias a su único receptor de luz acude rápidamente actuando como vector de polinización? Esa exactamente es la hipótesis… y a la revista Nature, una de las más importantes del mundo, la historia le pareció fascinante.
Por primera vez en la historia alguien encontraba una planta capaz de producir fluorescencia en la región del espectro electromagnético correspondiente al visible. Además esa fluorescencia tenía un valor fisiológico para la planta de gran interés… y la aparición del murciélago que no solo actuaba de vector de polinización sino que se alimentaba del polen de la flor del cactus cuadraba el círculo de esta gran historia.
Pero yo quiero añadir algo más… porque personalmente creo que hay algo que le da aun más valor añadido a esta historia. Como les he dicho anteriormente Fernando no perseguía ninguno de estos objetivos cuando comenzó su investigación. Sin embargo, tener la mente lo suficientemente abierta para no obcecarse en el objetivo inicial de su tesis doctoral, y darse cuenta de algo que nadie durante 50 años lo había visto a pesar de realizar los mismos procesos de purificación de las betalaínas del cactus, le sirvió para, a su temprana edad científica, poder publicar en una de las revistas más importantes del mundo… y eso no está al alcance de todos.
Una vez publicado aquel artículo en Nature, que no solo ayudó a abrir nuevas vías para el estudio de las relaciones entre animales y plantas sino que está ayudando a diseñar herramientas fluorescentes para combatir enfermedades como la malaria, Fernando Gandía continuó con lo que tenía programado para su tesis. La acabó, obteniendo el Premio Extraordinario de Doctorado de la UM por ella. Posteriormente hizo una estancia postdoctoral en la Universidad de York y afortunadamente pudo regresar a España con un contrato Ramón y Cajal. Es un GENIO. Con mayúsculas.
Jose
* Si te ha gustado esta historia puedes ayudarme a difundirla pinchando en este enlace. GRACIAS.
Bibliografía:
* Botany: Floral fluorescence effect. Fernando Gandía-Herrero, Francisco García-Carmona & Josefa Escribano. Nature 437, 334 , 2005.
* Flores fluorescentes. García Carmona, F. Gandía Herrero, F. Escribano, Josefa. Investigación y Ciencia. 45, 2011.
Nota 1: Aunque en este post me he centrado en al figura de Fernando Gandía Herrero, es justo indicar que sin la buena dirección de sus directores de tesis, los doctores Francisco García Carmona y Josefa Escribano Cebrián, nada de lo que han leído hubiese sido posible.
Nota 2: Este post participa en
- La II edición del Festival de la Cristalografía que se aloja en el blog Experientia Docet.
- La XXXI Edición del Carnaval de Química, cuyo blog anfitrión es ZTFNews.
- La XLVIII Edición del Carnaval de la Física que se celebra en el blog La Aventura de la Ciencia.
- La XXVIII Carnaval de Biología cuyo blog anfitrión es Vida y Estrellas (Divulgación Científica).
